Caracterização funcional de dois cDNAs homólogos à ciclofilina e à proteína reprimida por auxina (ARP) identificados em bibliotecas subtrativas a para floração em tomateiro

Flowering is a fundamental process in the life cycle for plant. This process is marked by vegetative to reproductive apical meristem conversion, due to interactions between several factors, both internal and external to plant. Therefore, eight subtractive libraries were constructed using apical meristem induced or not induced for two contrasting species: Solanum lycopersicum cv. Micro-Tom and Solanum pimpinellifolium. Several cDNAs were identified and among these, were selected two cDNAs: one homologous cDNA to cyclophilin (LeCYP1) and the other to Auxin repressed protein (ARP). It has observed that LeCYP1 and ARP genes are important in the developmental process to plants. In silico analysis, were used several databases with the exclusion criterion E-value <1.0x10-15. As a result, conservation was observed for proteins analyzed by means of multiple alignments and the presence of functional domains. Then, overexpression cassettes were constructed for the ARP cDNA in sense and antisense orientations. For this step, it was used the CaMV35S promoter. The cDNA orientation (sense or antisense) in relation to the promoter was determined by restriction enzymes and sequencing. Then, this cassette was transferred to binary vector pZP211 and these cassettes were transferred into Agrobacterium tumefaciens LBA4404. S. lycopersicum cv. Micro-Tom (MT) and MT-Rg1 plants were transformed. In addition, seedlings were subjected to hormone treatments using a synthetic auxin (- naphthalene acetic acid) and cyclosporin A (cyclophilin inhibitor) treatments and it was found that the hormone treatment there were changes in development of lateral roots pattern, probably related to decreases in auxin signaling caused by reduction of LeCYP1 in MT-dgt plants while cyclosporin A treatments, there was a slight delay in flowering in cv. MT plants. Furthermore, assay with real-time PCR (RT-qPCR) were done for expression level analysis from LeCYP1 and ARP in order to functionally characterize these sequences in tomato plants.

Resistência de genótipos de tomateiro a Tuta absoluta (Meyrick, 1917) (Lepidoptera: Gelechiidae) e efeito no comportamento e desenvolvimento de podisus nigrispinus (Dallas, 1851) (Hemiptera: Pentatomidae)

Pós-graduação em Agronomia (Entomologia Agrícola) - FCAV

Caracterização funcional de dois cDNAs homólogos à ciclofilina e à proteína reprimida por auxina (ARP) identificados em bibliotecas subtrativas a para floração em tomateiro

Flowering is a fundamental process in the life cycle for plant. This process is marked by vegetative to reproductive apical meristem conversion, due to interactions between several factors, both internal and external to plant. Therefore, eight subtractive libraries were constructed using apical meristem induced or not induced for two contrasting species: Solanum lycopersicum cv. Micro-Tom and Solanum pimpinellifolium. Several cDNAs were identified and among these, were selected two cDNAs: one homologous cDNA to cyclophilin (LeCYP1) and the other to Auxin repressed protein (ARP). It has observed that LeCYP1 and ARP genes are important in the developmental process to plants. In silico analysis, were used several databases with the exclusion criterion E-value <1.0x10-15. As a result, conservation was observed for proteins analyzed by means of multiple alignments and the presence of functional domains. Then, overexpression cassettes were constructed for the ARP cDNA in sense and antisense orientations. For this step, it was used the CaMV35S promoter. The cDNA orientation (sense or antisense) in relation to the promoter was determined by restriction enzymes and sequencing. Then, this cassette was transferred to binary vector pZP211 and these cassettes were transferred into Agrobacterium tumefaciens LBA4404. S. lycopersicum cv. Micro-Tom (MT) and MT-Rg1 plants were transformed. In addition, seedlings were subjected to hormone treatments using a synthetic auxin (- naphthalene acetic acid) and cyclosporin A (cyclophilin inhibitor) treatments and it was found that the hormone treatment there were changes in development of lateral roots pattern, probably related to decreases in auxin signaling caused by reduction of LeCYP1 in MT-dgt plants while cyclosporin A treatments, there was a slight delay in flowering in cv. MT plants. Furthermore, assay with real-time PCR (RT-qPCR) were done for expression level analysis from LeCYP1 and ARP in order to functionally characterize these sequences in tomato plants.

Product stability and sequestration mechanisms in Solanum tuberosum engineered to biosynthesize high value ketocarotenoids

To produce commercially valuable ketocarotenoids in Solanum tuberosum, the 4, 4′ β-oxygenase (crtW) and 3, 3′ β-hydroxylase (crtZ) genes from Brevundimonas spp. have been expressed in the plant host under constitutive transcriptional control. The CRTW and CRTZ enzymes are capable of modifying endogenous plant carotenoids to form a range of hydroxylated and ketolated derivatives. The host (cv. Désirée) produced significant levels of nonendogenous carotenoid products in all tissues, but at the apparent expense of the economically critical metabolite, starch. Carotenoid levels increased in both wild-type and transgenic tubers following cold storage; however, stability during heat processing varied between compounds. Subcellular fractionation of leaf tissues revealed the presence of ketocarotenoids in thylakoid membranes, but not predominantly in the photosynthetic complexes. A dramatic increase in the carotenoid content of plastoglobuli was determined. These findings were corroborated by microscopic analysis of chloroplasts. In tuber tissues, esterified carotenoids, representing 13% of the total pigment found in wild-type extracts, were sequestered in plastoglobuli. In the transgenic tubers, this proportion increased to 45%, with esterified nonendogenous carotenoids in place of endogenous compounds. Conversely, nonesterified carotenoids in both wild-type and transgenic tuber tissues were associated with amyloplast membranes and starch granules.

A digital imaging technique to quantify the incidence of internal browning in potato (Solanum tuberosum) tubers

Internal browning disorders, including brown fleck (BF), in potato (Solanum tuberosum) tubers greatly reduce tuber quality, but the causes are not well understood. This is due, in part, to the highly variable data provided by visual value-based rating systems. A digital imaging technique was developed to quantify accurately the incidence of internal browning in potato tubers. Images of tuber sections were scanned using a flatbed scanner and digitally enhanced to highlight tuber BF lesions, and the area of affected tissue calculated using pixel quantification software. Digital imaging allowed for the determination of previously unused indices of the incidence and severity of internal browning in potato tubers. Statistical analysis of the comparison between digitally derived and visual-rating BF data from a glasshouse experiment showed that digital data greatly improved the delineation of treatment effects. The F-test probability was further improved through square root or logarithmic data transformations of the digital data, but not of the visual-rating data. Data from a field experiment showed that the area of tuber affected by BF and the number of small BF lesions increased with time and with increase in tuber size. The results from this study indicate that digital imaging of internal browning disorders of potato tubers holds much promise in determining their causes that heretofore have proved elusive.

Glycoalkaloid Content and Starch Structure in Solanum Species and Interspecific Somatic Potato Hybrids

When genome sections of wild Solanum species are bred into the cultivated potato (S. tuberosum L.) to obtain improved potato cultivars, the new cultivars must be evaluated for their beneficial and undesirable traits. Glycoalkaloids present in Solanum species are known for their toxic as well as for beneficial effects on mammals. On the other hand, glycoalkaloids in potato leaves provide natural protection against pests. Due to breeding, glycoalkaloid profile of the plant is affected. In addition, the starch properties in potato tubers can be affected as a result of breeding, because the crystalline properties are determined by the botanical source of the starch. Starch content and composition affect the texture of cooked and processed potatoes. In order to determine glycoalkaloid contents in Solanum species, simultaneous separation of glycoalkaloids and aglycones using reversed-phase high-performance liquid chromatography (HPLC) was developed. Clean-up of foliage samples was improved using a silica-based strong cation exchanger instead of octadecyl phases in solid-phase extraction. Glycoalkaloids alpha-solanine and alpha-chaconine were detected in potato tubers of cvs. Satu and Sini. The total glycoalkaloid concentration of non-peeled and immature tubers was at an acceptable level (under 20 mg/100 g of FW) in the cv. Satu, whereas concentration in cv. Sini was 23 mg/100 g FW. Solanum species (S. tuberosum, S. brevidens, S. acaule, and S. commersonii) and interspecific somatic hybrids (brd + tbr, acl + tbr, cmm + tbr) were analyzed for their glycoalkaloid contents using liquid chromatography-electrospray ionization-mass spectrometry (LC-ESI-MS). The concentrations in the tubers of the brd + tbr and acl + tbr hybrids remained under 20 mg/100 g FW. Glycoalkaloid concentration in the foliage of the Solanum species was between 110 mg and 890 mg/100 g FW. However, the concentration in the foliage of S. acaule was as low as 26 mg/100 g FW. The total concentrations of brd + tbr, acl + tbr, and cmm + tbr hybrid foliages were 88 mg, 180 mg, and 685 mg/100 g FW, respectively. Glycoalkaloids of both parental plants as well as new combinations of aglycones and saccharides were detected in somatic hybrids. The hybrids contained mainly spirosolanes, and glycoalkaloid structures having no 5,6-double bond in the aglycone. Based on these results, the glycoalkaloid profiles of the hybrids may represent a safer and more beneficial spectrum of glycoalkaloids than that found in currently cultivated varieties. Starch nanostructure of three different cultivars (Satu, Saturna, and Lady Rosetta), a wild species S. acaule, and interspecific somatic hybrids were examined by wide-angle and small-angle X-ray scattering (WAXS, SAXS). For the first time, the measurements were conducted on fresh potato tuber samples. Crystallinity of starch, average crystallite size, and lamellar distance were determined from the X-ray patterns. No differences in the starch nanostructure between the three different cultivars were detected. However, tuber immaturity was detected by X-ray scattering methods when large numbers of immature and mature samples were measured and the results were compared. The present study shows that no significant changes occurred in the nanostructures of starches resulting from hybridizations of potato cultivars.

Features of a unique intronless cluster of class I small heat shock protein genes in tandem with box C/D snoRNA genes on chromosome 6 in tomato (Solanum lycopersicum)

Physical clustering of genes has been shown in plants; however, little is known about gene clusters that have different functions, particularly those expressed in the tomato fruit. A class I 17.6 small heat shock protein (Sl17.6 shsp) gene was cloned and used as a probe to screen a tomato (Solanum lycopersicum) genomic library. An 8.3-kb genomic fragment was isolated and its DNA sequence determined. Analysis of the genomic fragment identified intronless open reading frames of three class I shsp genes (Sl17.6, Sl20.0, and Sl20.1), the Sl17.6 gene flanked by Sl20.1 and Sl20.0, with complete 5' and 3' UTRs. Upstream of the Sl20.0 shsp, and within the shsp gene cluster, resides a box C/D snoRNA cluster made of SlsnoR12.1 and SlU24a. Characteristic C and D, and C' and D', boxes are conserved in SlsnoR12.1 and SlU24a while the upstream flanking region of SlsnoR12.1 carries TATA box 1, homol-E and homol-D box-like cis sequences, TM6 promoter, and an uncharacterized tomato EST. Molecular phylogenetic analysis revealed that this particular arrangement of shsps is conserved in tomato genome but is distinct from other species. The intronless genomic sequence is decorated with cis elements previously shown to be responsive to cues from plant hormones, dehydration, cold, heat, and MYC/MYB and WRKY71 transcription factors. Chromosomal mapping localized the tomato genomic sequence on the short arm of chromosome 6 in the introgression line (IL) 6-3. Quantitative polymerase chain reaction analysis of gene cluster members revealed differential expression during ripening of tomato fruit, and relatively different abundances in other plant parts.

Distribución y variabilidad de Ralstonia solanacearum e.f. Smith agente causal de marchitez bacteriana en el cultivo de papa (Solanum tuberosum L), en tres departamentos del norte de Nicaragua (Esteli, Matagalpa y Jinotega)

La marchitez bacteriana de la papa causada por Ralstonia solanacearum (E. F. Smith) es una de las principales limitantes en la producción de es te cultivo. R.olanacearum es una especie altamente variable, el estudio de su diversidad poblacional es un importante factor a considerar para su control. Con el objetivo de conocer la distribución y la variabilidad, se realizó un estudio durante el período comprendido de Septiembre de 2006 a Enero de 2007, en diferentes localidades distribuidas en tres departamentos de Nicaragua (Estelí, Matagalpa y Jinotega ), donde se recolectaron 18 muestras de tejidos vegetales (tubérculos y tallos) de papa (Solanum tuberosum L.) y suelo, las que fueron analizadas en laboratorio de Microbiología de la Universidad Nacional Agraria (UNA), para el aislamiento, identificación y multiplicación de la bacteria. Se realizaron siembras en plato petri que contenían medio de cultivo medio agar sacarosa-peptona. Posterior a su aislamiento se realizó purificación en un medio específico (tetrazolium). Las cepas bacterianas se identificaron mediante la determinación de características culturales, morfológicas, fisiológicas y bioquímicas. En el primer caso, se observaron características de borde, elevación, consistencia y color de las cepas individuales cultivadas en el medio agar sacarosa- peptona. Las características morfológicas se comprobaron a través observación en el microscopio óptico. La confirmación de las características fisiológicas y bioquímicas, se realizó a través de pruebas de KOH al 3%, oxidasa, catalasa y revelación de flagelos. Las colonias bacterianas identificadas como Ralstonia solanacearun, se les realizó la prueba de carbohidratos para la caracterización de biovares, basada en la utilización de azúcares y oxidación de alcoholes (Hayward, 1991). Las pruebas de hipersensibilidad se realizaron en plantas de tabaco (Nicotiana tabacumL.). Estas fueron inoculadas mediante la infiltración de la suspensión bacteriana de 24 hrs de crecimiento. Como resultado de la prueba, se identificaron dieciséis aislamientos pertenecientes al biovar 3 y dos aislamientos pertenecientes al biovar 1. Siendo el biovar 3 el más prevaleciente en los sitios de muestro. La raza fue identificada en base a sintomatología presentada, resultando ser la raza 1.

Comportamiento in vitro de tres variedades de papa (Solanum tuberosum L.) en tres variantes del medio básico de Murashige y Skoog (1962) y tres subcultivos

Actualmente el cultivo de tejidos vegetales como una de las técnicas más modernas en la agricultura, permite obtener elevados volúmenes de material vegetal de buena calidad para la siembra en numerosos cultivos, impactando directamente en el incremento de la calidad y rendimiento de las cosechas. El objetivo del presente trabajo fue evaluar el comportamiento de las variedades de papa Desirée, DT0-28 y Baraka en tres medios de cultivo: Ml (Sales MS + 0.5 mg/l * AIA + 0.2 mg/l Kinetina + 0.2 mg/1 Tiamina-HCL); M2 (Sales MS + 0.2 mg/l Tiamina-HCL) y M3 (Sales MS + 0.25 mg/l **GA3 + 0.2 mg/l Tiamina-HCL) y tres subcultivos continuos. Se evaluaron las variables Altura de plántula, Longitud de entrenudos y Número de hojas. Las tres variedades manifestaron una dinámica de crecimiento muy variada en los medios de cultivo y en los subcultivos, Desirée registró disminución del número de hojas en la medida que incrementaron los subcultivos. Igual tendencia mostró DT0-28. Por el contrario Baraka superó ligeramente el número de hojas en el subcultivo dos al obtenido en el subcultivo uno, alcanzando los valores más altos en el subcultivo tres. Desirée y Baraka presentaron un comportamiento aceptable en el medio dos y DT0-28 en el medio tres. *AlA = Acido lndolAcético **G3 = Acido Giberélico

Evaluación de semilla sexual hibrida de papa (Solanum tuberosum L.) provenientes del Centro Internacional de la Papa e India en la zona de Miraflor, Esteli

Con el objetivo de seleccionar progenies promisorias de semilla sexual de papa, procedentes del CIP (11) y Programa de la India (3) se estableció este ensayo el 21 de septiembre de 1994, utilizando un diseño de Bloques Completos al Azar (BCA) con cuatro repeticiones, en la estación experimental del Instituto Nicaragüense de Tecnología Agropecuaria (INTA-RB-3), ubicada a 1 350 msnm, humedad relativa del 91 por ciento, temperatura promedio mínima 15 °C/máx 26 °C, cuyos suelos son de textura franca bien drenada, medianamente profundo a profundo, con una precipitación durante el ensayo de 622 mm. Los resultados obtenidos muestran que todas las progenies híbridas enviadas por el CIP mostraron buena velocidad de emergencia en especial SERRANA x LT-7, con respecto a los lubridos de la India. En general el porcentaje de sobrevivencia fue mayor del 80 por ciento para la mayoría de las progenies el cual es un índice aceptable, a excepción de 104.12 LB x TS-4.En la altura final de la planta no hubieron diferencias significativas entre híbridos, solo fueron superiores a KATADIN x TS-10. En cuanto al rendimiento, la progenie HPS­ II/67 mostró ser superior a las demás con 6.2 kg/m2. El número total de tubérculos por metro cuadrado {740) y tubérculos por planta (7) fue superior en la progenie TS-6 x TPS-67. Las progenies de ambos programas mostraron rendimientos por metro cuadrado de más del 50 por ciento con tubérculos mayores de 5 gramos. No se presentó incidencia de virus para ambas progenies, las tres progenies provenientes del Programa de la India presentaron mayor resistencia a tizón tardío (Phytophthora infestans, Mont. D.bary).

Evaluación de adaptabilidad de doce variedades de papa (Solanum tuberosum L) y su tolerancia al tizón tardío (Phytophthora infestans (Mont.) de Bary) en Santa Rosa, Jinotega

El objetivo del presente trabajo consistió en la evaluación de la adaptabilidad de 12 variedad es de papa (Solanum tuberosum L) y su tolerancia a Tizón Tardío (Phytophthora infestans Mont. De Bary). El ensayo se estableció el 8 de Febrero en la comunidad Santa Rosa Departamento de Jinotega, utilizándose un diseño de bloques completo al azar (BCA),con cuatro repeticiones a las que se les dio un seguimiento continuo para la recopilación de los datos a evaluar posteriormente. Los datos obtenidos en campo fueron analizados con el programa estadístico SAS. Las variedades evaluados fueron: Picasso, Amorosa, Sante, Fontane, Kuroda, Provento, Kónsul, Arnova, Arinda, Sinora, Roko y Papanica como testigo. Las variables evaluadas fueron: Incidencia a Tizón tardío en donde las variedades Papanica presento 67.5, Provento 75, Konsul 77.5, Roko 82, y Sante 82.5 porciento a los 55 DDS con respecto a las demás variedades; porcentaje de incidencia con respecto a las demás variedades; Porcentaje de severidad del área foliar infestada las variedades anteriormente mencionadas mostraron a los 82DDS 90.5, 79.5, 66.5, 94, 96 porciento. Lesión al tallo las variedades Provento, Sinora y Papanica tuvieron a los 80 DDS el grado 1 con respecto a la escala utilizada. Dentro de las plagas foliares las variedades Fontane, y kuroda obtuvieron como promedio 14 afidos por planta a los 37 DDS y las variedades Amorosa, Sante y Fontane obtuvieron como promedio 2 moscas por plantas a los 63 y 78 DDS. En cuanto a la Incidencia de virus no se encontró significancia estadística en los tratamientos evaluados en las diferentes fechas. Una vez realizado el análisis de varianza se encontró que la variedad Provento ocupa el mayor rendimiento en la categoría rendimiento de primera y segunda con 5.75 y 2.04 t ha-1. En la tercera categoría las variedades Papanica y Arinda mostraron alto rendimiento con 1.04 y 0.96 t ha-1. El análisis económico refleja que las variedades Provento, Sante y Papanica obtuvieron un beneficio neto de 4,069; 12,429 y 8201 C$/ha.

Evaluacion de diferentes niveles de fertilizantes NPK en la produccion de minituberculos de papa (Solanum tuberosum L.) en semillero para la producción comercial, proveniente de semilla sexual, variedad ATZIMBA

La papa es una fuente de alimentación importante a nivel mundial, en Nicaragua los altos costos de importación de semilla de buena calidad, tiene como efecto, la dificultad de los productores de aumentar áreas de siembra y el bajo consumo con respecto a otros países por el costo de este producto. La falta de un programa nacional de producción de semilla contribuye al problema, ya que muchos productores no tienen acceso a semilla, pero al introducir la semilla botánica de papa para producción de minituberculos, hace que el productor demande nuevos conocimientos, por tanto hay que desarrollarlos, uno de estos conocimientos es la dosis de fertilización adecuada en semillero de papa para la producción de minituberculos. Existen estudios en otros países como Perú, pero no son adaptables a nuestras condiciones, por tal motivo se estableció un ensayo en el Mojón, Jinotega, el cual comprendió de septiembre a diciembre del 2002, el diseño utilizado fue el de Bloques Completos al Azar (BCA), donde se evaluaron cinco dosis de fertilizantes. El área experimental fue de 105 m2, la comparación de medias se realizo por Duncan al 0.05 de probabilidad. Los objetivos del ensayo fueron: objetivo general: Evaluar el efecto de distintos niveles de fertilización sobre la producción de mini tubérculos de papa (Solanum tuberosum L.) en semillero, proveniente de semilla sexual o semilla verdadera. Objetivos específicos: Estudiar el efecto de diferentes dosis de fertilizantes en almacigo para la producción de minituberculos de papa, determinar la dosis con las que se obtienen los mejores rendimientos en la producción de minituberculos de papa, y realizar un análisis Beneficio–Costo de los resultados obtenidos para determinar cual es el tratamiento que económica y productivamente es el más rentable. Los parámetros evaluados fueron: altura de plantas, plantas cosechadas, cuatro categorías de peso de tubérculos y número de tubérculos totales por hectárea, además el rendimiento de minitubérculos de papa. No se encontró evidencia estadísticas que alguna dosis aumente el numero de tubérculos por hectárea, pero, se demostró que la aplicación de 300 a 450 kilogramos de urea, 270 a 420 kilogramos del fertilizante 18-46-00 y 80 a 130 kilogramos de sulfato de amonio aumenta el rendimiento en peso de minitubérculos, y la ganancia de los productores aumenta de 133 000 a 139 300 córdobas por hectárea. Aplicaciones mayores de fertilizantes causan perdidas hasta en 41 600 córdobas por hectárea con respecto a la aplicación de los productores.

Evaluación de alternativas químicas y biológicas en el manejo del tizón tardío (Phitopthora infestans, (Mont.) de Bary) en el cultivo de papa (Solanum tuberosum)

El presente trabajo tuvo como objetivo la evaluación del efecto de alternativas químicas y biológicas para el manejo del tizón tardío [Phytophthora infestans (Mont.) De Bary]. El ensayo se estableció en Aranjuez, Matagalpa en los meses de Octubre 2006 a Enero 2007, utilizando el diseño de bloques completo al azar (BCA) con ocho tratamientos y cuatro repeticiones donde se evaluaron fungicidas de contacto y sistémicos, incluyendo también un fungicida biológico como preventivo. Las aplicaciones se hicieron antes que aparecieran los primeros síntomas con fungicidas de contacto, después de los primeros síntomas las aplicaciones con sistémicos, no más de tres aplicaciones, excepto en el tratamiento 3 que fue a criterio del productor. Los tratamientos utilizados fueron: un testigo al cual no se le aplico ningún fungicida, T1 (Mancozeb + Alliete), T2 (Bravonil + Equation), T3 (Hachero + Curzate), T4 (Mancozeb + Amistar), T5 (Serenade + Flint), T6 (Mancozeb + Curzate) y T7 (Serenade + Curzate). La variedad utilizada fue Calwhite variedad susceptible a esta enfermedad, posteriormente los datos registrados durante el ensayo fueron analizados con el programa estadístico SAS v ersión 9.1.3. Las variable evaluadas fueron: severidad, área bajo la curva de progreso de la enfermedad (ABCPE) y de acuerdo a esto se diagramó la curva de progreso de la enfermedad (CPE), donde los resultados muestran que el tratamiento 5 no tuvo ningún efecto en el control de la enfermedad, al igual que el testigo mostrando siempre una fase exponencial a partir de la segunda semana después de haber emergido el total de las plantas, hasta alcanzar su máximo porcentaje de severidad. El tratamiento 3 mantuvo su fase logarítmica hasta los 43 días después de la emergencia (dde) con un porcentaje de severidad menor al 25% y los tratamientos 1, 2, 4 y 7 mostraron su fase exponencial después de los 43 dde, en cambio el tratamiento 6 mostró una sola fase logarítmica, siendo este el mas efectivo para el manejo de la enfermedad.